整个操作流程预计需时约1小时,包含样品匀浆、细胞裂解、去蛋白质及DNA纯化等步骤,具体过程如下:
一、样品匀浆与细胞裂解
在进行基因组DNA提取时,根据不同实验材料应采取相应的匀浆方法。以下是两种主要的提取来源:
1. 从动物组织中提取基因组DNA
使用研钵匀浆时,请遵循以下步骤:
① 取1~100mg动物组织或人组织,放入预冷的研钵中,快速、用力进行匀浆。
注:对于以下组织,须加液氮研磨成粉末状:
A. 富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。
B. 富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等。
C. 富含角质蛋白或坚硬组织(如骨骼)。
② 加入650μl的Solution A和0.9μl的RNase A1,温和研磨30秒。
注:若使用上文提及的组织,加入Solution A和RNase A后,将研钵置于65℃水浴中研磨1分钟。
③ 收集650μl匀浆液至Collection Tube中,如匀浆量不足650μl,补加Solution A至该体积,并在65℃水浴中保温5分钟。
使用研磨棒匀浆时的操作:
① 取1~100mg动物组织,放入冰浴预冷的Collection Tube中,快速研磨成糊状。
② 加入350μl的Solution A和0.9μl的RNase A1,继续用研磨棒研磨成匀浆。
③ 加入350μl的Solution A,将研磨棒上的匀浆导入Collection Tube,充分混合后,65℃保温5分钟。
2. 从植物材料或培养细胞中提取基因组DNA
按照下表称取适量新鲜植物材料(冷冻干燥材料用量减半),剪成小块放入研钵中,加入液氮,等待样品完全冷冻后,快速、用力研磨至粉末状。注意研磨时应间歇性加入液氮,以防材料融化。
植物材料种类 | 使用量 |
---|---|
植物花、叶片 | 10~100mg |
植物茎 | 60~240mg |
植物根 | 80~240mg |
植物种子 | 80~240mg |
注:若使用根、种子等样品,由于其基因组DNA含量较低,需使用大于上述参数的量,请分两管进行实验,最后在过滤时合并至同一Spin Column上。
若提取培养植物细胞中的DNA,应收集2×103~1×107的植物细胞,加入150μl水充分悬浮后,进行研磨。
注:研磨应充分,以提高基因组DNA的收率。
二、从全血中提取基因组DNA
① 取10~250μl抗凝全血加入Collection Tube中。
② 加入500μl的Solution A。
③ 加入1μl的RNase A1,激烈振荡15秒后冰浴5分钟。
注:一次处理人或动物抗凝全血≤250μl;禽类、两栖类抗凝全血≤10μl。
三、从培养细胞中提取基因组DNA
对于悬浮培养的动物细胞:
① 收集1×105~1.5×107的细胞悬浮液,5,000rpm离心5分钟,弃上清。
② 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。
③ 加入500μl的Solution A和0.8μl的RNase A1,激烈振荡15秒,然后室温静置1分钟。
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